Напишите нам
Ваше сообщение отправлено!
Напишите нам
Закрыть

Мастити корів. Результати досліджень за 2016 рік

Мастити корів. Результати досліджень за 2016 рік

Вступ

В ТОВ «Центр ветеринарної діагностики» щорічно проводиться значна кількість досліджень зразків молока з різних тваринницьких господарств України. Основною метою цих досліджень є виявлення збудників маститів та вивчення їх чутливості до антибіотиків.

Мета

Метою даної статті є аналіз даних лабораторних досліджень зразків молока, проведених у 2016 році.

Матеріали і методи

Отримані зразки молока приблизно з 20 господарств України досліджували бактеріологічним методом (для діагностики маститів бактеріальної та грибкової етіології) та методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (для діагностики маститів, спричинених Mycoplasma spp.).

Виділення мікрофлори із досліджуваних зразків молока проводили на кров’яному агарі виробництва BioMerieux (Франція) та Biocorp (Польща). Для попередньої ідентифікації та селективного виділення застосовували агар МакКонкі, манітно-сольовий агар, агар Едвардса, агар Сабуро, виробництва Himedia (Індія) та Biolife (Італія). Ідентифікацію виділених бактеріальних ізолятів проводили за допомогою комерційних тест-систем API 20E BioMerieux (Франція) та STREPTOtest 16 Erba Lachema (Чехія). Визначення чутливості виділених ізолятів до антибіотиків проводили диско-дифузійним методом на агарі Мюллера-Хінтона з використанням стандартних комерційних дисків виробництва Himedia (Індія) та Conda (Іспанія).

Для виявлення генетичного матеріалу Mycoplasma spp. в зразках молока використовували in-house ПЛР. В основі методики лежить виділення сумарної ДНК, ампліфікація специфічної ділянки гена та візуалізація результатів у агаразному гелі. Для виділення нуклеїнових кислот використовували автоматичний екстрактор – «Bead Retriever», Invitrogen, США та набір реагентів «MagVet Universal Isolation Kit», LSI, Німеччина), принцип яких полягає в адсорбції нуклеїнових кислот на поверхні магнітних частинок. Для постановки реакції ампліфікації використовували реагенти та матеріали для проведення ПЛР, а саме: DreamTaq ДНК-полімераза (5 од.акт./мкл), магній хлорид (MgCl2+) ПЦР-буфер (10Х буферний розчин DreamTaq Green Buffer), 10 мМ dNTP-mix (дезоксинуклеотидтрифосфати) - Thermo Fisher Scientific, Німеччина та специфічні олігонуклеотидні праймери (очистка OPC, компанія Metabion, Німеччина). Олігонуклеотидні послідовності підбирали на основі аналізу даних щодо послідовності відповідних генів за допомогою пакета програм Vector NTI Advanced 11.

Результати

Результати досліджень в таблицях і діаграмах наведені нижче.

На мікоплазму було досліджено 20 зразків молока методом ПЛР, і позитивними виявилися 2 з них.

Обговорення

З 92 зразків молока 20 були контамінованими (забрудненими сторонньою мікрофлорою), що становить 22% від загальної кількості досліджуваних зразків. Це досить значний відсоток, який свідчить про порушення асептичної техніки та нехтування правилами відбору зразків молока для досліджень (наприклад, відбір та надсилання зразків у шприцах – дивись фото 1), що в результаті веде до марних витрат грошей і часу. В більшості лабораторій світу, якщо із зразка молока висівається більше ніж 2-3 різні види мікроорганізмів, такий зразок вважається контамінованим і виключається із подальших досліджень. Це зумовлено тим, що теоретично будь-який мікроорганізм може спричинити інфекцію вимені, але вважається малоймовірним, щоб мастит викликали більше 2-х різних мікроорганізмів одночасно.

Фото 1. Зразки молока, надіслані в шприцах (від’єднання канюлі та поршня й витікання молока із шприца під час транспортування; стирання маркування зразка).

Фото 2. Колонії різних видів мікроорганізмів (більше 3-х різних видів), виділені з проби молока на кров’яному агарі – контамінований зразок.

Невеличкий відсоток (9%) становили негативні зразки, тобто ті, з яких не було виділено жодної мікрофлори. Таке часто трапляється, особливо із зразками, відібраними від корів з клінічною формою маститу. Це може бути зумовлено багатьма причинами, основні з яких: суттєве коливання pН в молоці; наявність значної кількості клітин запалення та різних хімічних речовин, які з’являються в молоці під час запалення (ферменти, гормони, продукти розпаду клітин та ін.) та пригнічують бактеріальну мікрофлору; періодичне незначне виділення, або ж невиділення збудника з молоком (при маститах, спричинених S.aureus); асептична (неінфекційна) природа запалення; порушення умов зберігання та транспортування відібраних зразків молока (порушення температурного режиму) та ін.

Щодо спектру виділених збудників, то на контагіозні (заразні) збудники маститів припало 41% всіх виділених ізолятів: 15% - S.aureus і 26% - S.agalactiae, а на незаразні (з навколишнього середовища) збудники маститу – 59%.

З незаразних більшість бактерій відноситься до Грам (+) мікрофлори, а саме до стрептококів (22,5% - Streptococcus spp.) і стафілококів (14% - Staphylococcus spp.). На Грам (-) мікрофлору прийшлося 18,5% всіх виділених ізолятів: 11% - E.coli, 6% - Psteurella spp., 1,5% - Proteus spp.

Мастити, викликані грибками (дріжджі) та мікоплазмами (Mycoplasma spp.), становили відповідно 1,5% і 3% всіх діагностованих маститів.

Чутливість виділених збудників маститів до антибіотиків відображено в таблиці 2, 3 і діаграмах 2 і 3.

Як видно із наведених в таблицях даних, більшість виділених ізолятів були чутливими до Амоксиклаву (Amoxicillin+ Сl. Acid) і Гентаміцину (Gentamicin) - 93,5%. Найменша кількість ізолятів була чутливою до Тилозину (Tylosin) – 20,9 % і Стрептоміцину (Streptomycin) – 48,3%. Значний відсоток (83,8%-54,8%) отриманих ізолятів були чутливими (в порядку спадання) до: Рифампіцину (Rifampicin), Амоксициліну (Amoxicillin), Бацитрацину (Bacitracin), Клоксациліну (Cloxacillin), Триметоприму (Trimethoprim), Флорфеніколу (Florfenicol), Ампіциліну (Ampicillin), Лінкоміцину (Lincomycin), Цефалексину (Cephalexin), Енрофлоксацину (Enrofloxacine), Неоміцину (Neomycin), Пеніциліну (Penicillin).

Чутливість до антибіотиків контагіозних збудників S.aureus і S.agalactiae була приблизно однаковою (Діаграма 3). Більшість ізолятів контагіозних збудників були чутливими до Амоксициліну, Амоксиклаву, Гентаміцину, Ампіциліну, Лінкоміцину, Клоксациліну, Рифампіцину, Бацитрацину, Цефалексину і Триметоприму; а резистентними до Тилозину та Стрептоміцину.

Чутливість ізолятів E.coli дещо відрізняється від інших. Так всі 7 ізолятів цього збудника були резистентними до Амоксициліну, Пеніциліну, Тилозину, Неоміцину, Лінкоміцину, Клоксациліну, Рифампіцину, Бацитрацину і Цефалексину. До Ампіциліну були резистентними 6 із 7 ізолятів, а до Стрептоміцину – 5 із 7. Всі виділені ізоляти E.coli були чутливими до Гентаміцину і Триметоприму (100%) і значний відсоток (86%) – до Амоксиклаву та Енрофлоксацину.

Висновки

Значний відсоток зразків (22%), які надійшли для дослідження були контамінованими, що свідчить про невідповідну техніку відбору та порушення процедури зберігання і передачі зразків для лабораторних досліджень. Для попередження контамінації зразків слід чітко дотримуватись існуючих рекомендацій (наприклад NMC – дивись посилання) та проводити відповідні тренінги для персоналу.

Більшість маститів спричиняє Грам (+) мікрофлора, а саме стрептококи – 48,5% всіх діагностованих маститів.

Серед збудників Грам (-) мікрофлори більшість маститів викликає кишкова паличка, але по відношенню до загальної кількості діагностованих маститів відсоток колійних маститів невеликий і склав всього 11%.

Щодо маститів, спричинених мікоплазмами (Mycoplasma spp.), то незважаючи на невелику їх кількість (2 позитивних зразки з 20 досліджуваних), слід рекомендувати проводити постійні моніторингові дослідження для виявлення позитивних особин, через те, що збудник цей контагіозний, погано піддається лікуванню (антибіотикотерапія мікоплазмозних маститів не є ефективною) та крім маститів викликає пневмонії, а також системні захворювання.

Кількість заразних (контагіозних) і незаразних маститів майже однакова, що підтверджує необхідність проведення лабораторних досліджень та ідентифікації збудників, через те, що ця інформація суттєво впливає на вибір протимаститної програми.

З огляду на отримані дані, протимаститним антибіотиком номер один можна назвати Amoxicillin+ Сl. Acid і Gentamicin. Антибіотиком останнього вибору виявився Tylosin.

Інформація щодо чутливості збудників маститів до антибіотиків корисна більше для виробників і продавців антибіотиків та діагностів, через те, що в кожному конкретному випадку маститу необхідно виділяти та ідентифікувати збудника й отримувати індивідуальну антибіотикограму.

Денис Древаль
Денис Древаль
Заведующий лабораторией патанатомии и бактериологии
Татьяна Пономаренко
Татьяна Пономаренко
Зав лабораторії молекулярної діагностики